Protein Solution Viscosity Control in Ultrafiltration

Nadzorovanje viskoznosti beljakovinskih raztopin je ključnega pomena za optimizacijo procesov ultrafiltracijske koncentracije v biofarmacevtski proizvodnji. Povišana viskoznost beljakovinskih raztopin – zlasti pri visokih koncentracijah beljakovin – neposredno vpliva na delovanje membrane, učinkovitost procesa in ekonomičnost pri ultrafiltracijski koncentraciji beljakovin. Viskoznost raztopine se povečuje z vsebnostjo beljakovin zaradi združevanja protiteles in elektrostatičnih interakcij, ki povečajo odpornost proti toku in padec tlaka na ultrafiltracijski membrani. To ima za posledico nižje pretoke permeata in daljše obratovalne čase, zlasti pri procesih filtracije s prečnim tokom (TFF).

Transmembranski tlak (TMP), gonilna sila ultrafiltracije, je tesno povezan z viskoznostjo. Delovanje zunaj normalnega območja transmembranskega tlaka pospešuje obraščanje membrane in poslabša koncentracijsko polarizacijo – kopičenje beljakovin v bližini membrane, ki nenehno povečuje lokalno viskoznost. Tako koncentracijska polarizacija kot obraščanje membrane povzročita zmanjšano delovanje ultrafiltracijske membrane in lahko skrajšata življenjsko dobo membrane, če ju ne nadzorujemo. Eksperimentalno delo kaže, da sta obraščanje membrane in koncentracijska polarizacija pri ultrafiltraciji bolj izrazita pri višjih vrednostih TMP in pri bolj viskoznih dovodih, zato je nadzor TMP v realnem času bistven za povečanje pretočnosti in zmanjšanje pogostosti čiščenja.

Optimizacija koncentracije ultrafiltracije zahteva integrirane strategije:

Merjenje viskoznosti beljakovinske raztopineRedne ocene viskoznosti – z uporabolinijski viskozimetri—pomagajo napovedati stopnje filtracije in predvideti ozka grla v procesu, kar podpira hitre spremembe procesa.
Kondicioniranje krmePrilagajanje pH-ja, ionske moči in temperature lahko zniža viskoznost in zmanjša obraščanje. Na primer, dodajanje natrijevih ionov poveča odbojnost hidratacije med beljakovinami, kar zmanjša agregacijo in obraščanje, medtem ko kalcijevi ioni običajno spodbujajo premostitev in obraščanje beljakovin.
Uporaba pomožnih snoviVključitev pomožnih snovi, ki znižujejo viskoznost, v visoko koncentrirane beljakovinske raztopine izboljša prepustnost membrane in zmanjša transmembranski tlak pri ultrafiltraciji, kar poveča splošno učinkovitost.
Napredni režimi pretokaPovečanje hitrosti prečnega toka, uporaba izmeničnega prečnega toka ali uporaba vbrizgavanja zračnega curka moti plasti obraščanja. Te tehnike pomagajo ohranjati pretok permeata in zmanjšati pogostost zamenjave membrane z zmanjševanjem nastajanja usedlin.
Izbira in čiščenje membraneIzbira kemično odpornih membran (npr. SiC ali termoplastičnih hibridov) in optimizacija pogostosti čiščenja membran z ustreznimi protokoli (npr. čiščenje z natrijevim hipokloritom) sta ključnega pomena za podaljšanje življenjske dobe membran in zmanjšanje obratovalnih stroškov.

Na splošno sta učinkovit nadzor viskoznosti in upravljanje TMP temelj uspešne ultrafiltracijske koncentracijske faze, ki neposredno vplivata na izkoristek produkta, pogostost čiščenja membran in dolgo življenjsko dobo dragih membranskih sredstev.

Razumevanje viskoznosti beljakovinskih raztopin pri ultrafiltraciji

1.1. Kakšna je viskoznost beljakovinskih raztopin?

Viskoznost opisuje upor tekočine proti pretoku; v raztopinah beljakovin označuje, koliko molekularnega trenja ovira gibanje. Enota SI za viskoznost je paskal-sekunda (Pa·s), za biološke tekočine pa se običajno uporablja centipoaz (cP). Viskoznost neposredno vpliva na to, kako enostavno je mogoče raztopine beljakovin črpati ali filtrirati med proizvodnjo, in vpliva na dajanje zdravil, zlasti pri visokokoncentriranih bioterapevtikih.

Koncentracija beljakovin je prevladujoči dejavnik, ki vpliva na viskoznost. Z naraščanjem ravni beljakovin se povečajo medmolekularne interakcije in gneča, kar povzroči naraščanje viskoznosti, pogosto nelinearno. Nad določenim pragom interakcije beljakovin-beljakovine dodatno zavirajo difuzijo znotraj raztopine. Na primer, koncentrirane raztopine monoklonskih protiteles, ki se uporabljajo v farmacevtskih izdelkih, pogosto dosežejo ravni viskoznosti, ki otežujejo subkutano injiciranje ali omejujejo hitrost obdelave.

Modeli, ki napovedujejo viskoznost v koncentriranih raztopinah beljakovin, zdaj vključujejo molekularno geometrijo in tendence agregacije. Morfologija beljakovin – ne glede na to, ali je podolgovata, kroglasta ali nagnjena k agregaciji – pomembno vpliva na viskoznost pri visokih koncentracijah. Nedavni napredek pri mikrofluidnem ocenjevanju omogoča natančno merjenje viskoznosti iz minimalnih volumnov vzorcev, kar omogoča hitro presejanje novih formulacij beljakovin.

1.2. Kako se viskoznost spreminja med ultrafiltracijo

Med ultrafiltracijo koncentracijska polarizacija hitro kopiči beljakovine na vmesniku med membrano in raztopino. To ustvarja strme lokalne koncentracijske gradiente in povečuje viskoznost v bližini membrane. Povečana viskoznost v tem območju ovira prenos mase in zmanjšuje pretok permeata.

Koncentracijska polarizacija se razlikuje od obraščanja membrane. Polarizacija je dinamična in reverzibilna ter se pojavi v nekaj minutah med potekom filtracije. V primerjavi s tem se obraščanje razvija sčasoma in pogosto vključuje ireverzibilno odlaganje ali kemično transformacijo na površini membrane. Natančna diagnostika omogoča sledenje plasti koncentracijske polarizacije v realnem času in razkriva njeno občutljivost na hitrost prečnega toka in transmembranski tlak. Na primer, povečanje hitrosti ali zmanjšanje transmembranskega tlaka (TMP) pomaga pri motenju viskozne mejne plasti in obnovi pretok.

Obratovalni parametri neposredno vplivajo na viskoznost:

Transmembranski tlak (TMP)Višji TMP intenzivira polarizacijo, kar poveča lokalno viskoznost in zmanjša pretok.
Hitrost prečnega tokaPovečana hitrost omejuje kopičenje in uravnava viskoznost v bližini membrane.
Pogostost čiščenja membranPogosto čiščenje zmanjšuje dolgotrajno nabiranje in blaži izgubo zmogljivosti zaradi viskoznosti.

Faze ultrafiltracijske koncentracije morajo optimizirati te parametre, da se čim bolj zmanjšajo neželeni učinki viskoznosti in ohrani prepustnost.

1.3. Lastnosti beljakovinskih raztopin, ki vplivajo na viskoznost

Molekulska težainsestavapredvsem določajo viskoznost. Večji, bolj kompleksni proteini ali agregati dajejo višjo viskoznost zaradi oviranega gibanja in večjih medmolekularnih sil. Oblika proteinov dodatno modulira pretok – podolgovate ali k agregaciji nagnjene verige povzročajo večji upor kot kompaktni globularni proteini.

pHkritično vpliva na naboj in topnost beljakovin. Prilagajanje pH raztopine blizu izoelektrične točke beljakovine zmanjša neto naboj, zmanjša odboj med beljakovinami in začasno zniža viskoznost, kar olajša filtracijo. Na primer, izvajanje ultrafiltracije blizu izoelektrične točke BSA ali IgG lahko znatno poveča pretok permeata in selektivnost ločevanja.

Ionska močVpliva na viskoznost s spreminjanjem električne dvojne plasti okoli beljakovin. Povečana ionska moč preprečuje elektrostatične interakcije, kar spodbuja prenos beljakovin skozi membrane, hkrati pa povečuje tveganje za agregacijo in posledične skoke viskoznosti. Kompromis med učinkovitostjo prenosa in selektivnostjo je pogosto odvisen od natančne nastavitve koncentracij soli in sestave pufra.

Za zmanjšanje viskoznosti se lahko uporabijo majhni molekularni dodatki, kot sta arginin hidroklorid ali gvanidin. Ta sredstva motijo hidrofobne ali elektrostatične privlačnosti, zmanjšujejo agregacijo in izboljšujejo lastnosti pretoka raztopine. Temperatura deluje kot nadaljnja kontrolna spremenljivka; nižje temperature povečajo viskoznost, medtem ko jo dodatna toplota pogosto zmanjša.

Pri merjenju viskoznosti beljakovinske raztopine je treba upoštevati:

Porazdelitve molekulskih mas
Sestava raztopine (soli, pomožne snovi, dodatki)
Izbira pH in puferskega sistema
Nastavitev ionske moči

Ti dejavniki so ključni za optimizacijo delovanja ultrafiltracijske membrane in zagotavljanje doslednosti med fazami koncentracije in procesi TFF.

Osnove ultrafiltracijske koncentracije beljakovin

Načela ultrafiltracijske koncentracijske faze

Ultrafiltracijska koncentracija beljakovin deluje tako, da se čez polprepustno membrano izvaja transmembranski tlak (TMP), ki potiska topilo in majhne topljence skozi membrano, hkrati pa zadržuje beljakovine in večje molekule. Postopek izkorišča selektivno permeacijo na podlagi velikosti molekul, pri čemer mejna molekulska masa membrane (MWCO) določa največjo velikost molekul, ki prehajajo. Beljakovine, ki presegajo MWCO, se kopičijo na strani retentata, kar povečuje njihovo koncentracijo, ko se permeat odvaja.

Faza ultrafiltracijske koncentracije je usmerjena v zmanjšanje volumna in obogatitev beljakovinske raztopine. Z napredovanjem filtracije se viskoznost beljakovinske raztopine običajno povečuje, kar vpliva na zahteve glede pretoka in TMP. Zadržane beljakovine lahko interagirajo med seboj in z membrano, zaradi česar je proces v resničnem svetu bolj zapleten kot preprosto izključevanje velikosti. Elektrostatične interakcije, agregacija beljakovin in značilnosti raztopine, kot sta pH in ionska moč, vplivajo na rezultate zadrževanja in ločevanja. V nekaterih primerih advektivni transport prevladuje nad difuzijo, zlasti v membranah z večjimi porami, kar otežuje pričakovanja, ki temeljijo izključno na izbiri MWCO [glej povzetek raziskave].

Razlaga prečne filtracije (TFF)

Prečna filtracija, imenovana tudi tangencialna filtracija (TFF), usmerja beljakovinsko raztopino tangencialno čez površino membrane. Ta pristop je v nasprotju s filtracijo s slepim koncem, kjer je tok pravokoten na membrano in delce potiska neposredno na in v filter.

Ključne razlike in vplivi:

Nadzor obraščanja:TFF zmanjšuje nabiranje beljakovinskih in delcev, znano kot nastajanje kolača, tako da neprekinjeno odstranjuje morebitne onesnaževalce z membrane. To ima za posledico stabilnejši pretok permeata in lažje vzdrževanje.
Zadrževanje beljakovin:TFF podpira boljše upravljanje koncentracijske polarizacije – plast zadržanih molekul blizu membrane – ki lahko, če ni nadzorovana, zmanjša selektivnost ločevanja in poveča obraščanje. Dinamični tok v TFF blaži ta učinek in pomaga ohranjati visoko zadrževanje beljakovin in učinkovitost ločevanja.
Stabilnost fluksa:TFF omogoča daljša obratovalna obdobja pri enakomernem pretoku, kar povečuje učinkovitost v procesih z visoko vsebnostjo beljakovin ali delcev. Nasprotno pa filtracijo v slepi ulici hitro ovirajo usedline, kar zmanjša prepustnost in zahteva pogoste posege čiščenja.

Napredne različice TFF, kot je izmenični tangencialni tok (ATF), dodatno motijo obraščanje in nastajanje kolača s periodičnim obračanjem ali spreminjanjem tangencialnih hitrosti, s čimer podaljšajo življenjsko dobo filtra in izboljšajo prepustnost beljakovin [glej povzetek raziskave]. Tako v klasičnih kot v naprednih nastavitvah TFF je treba operativne nastavitve – kot so TMP, hitrost prečnega toka in pogostost čiščenja – prilagoditi specifičnemu beljakovinskemu sistemu, vrsti membrane in ciljni koncentraciji, da se optimizira delovanje in zmanjša obraščanje.

Transmembranski tlak (TMP) pri ultrafiltraciji

3.1. Kaj je transmembranski tlak?

Transmembranski tlak (TMP) je tlačna razlika na filtracijski membrani, ki premika topilo od dovodne strani proti permeatni strani. TMP je glavna sila ločevalnega procesa pri ultrafiltraciji, ki omogoča prehod topila skozi membrano, hkrati pa zadržuje beljakovine in druge makromolekule.

Formula TMP:

Preprosta razlika: TMP = P_dovod − P_permeat
Inženirska metoda: TMP = [(P_dovod + P_retentat)/2] − P_permeat
Tukaj je P_fead vhodni tlak, P_retentat izhodni tlak na strani retentata in P_permeat tlak na strani permeata. Vključitev tlaka retentata (ali koncentrata) zagotavlja natančnejšo vrednost vzdolž površine membrane, pri čemer se upoštevajo tlačni gradienti, ki jih povzročata upor pretoka in obraščanje.
Dovodni tlak in pretok
Tlak retentata (če je primerno)
Permeatni tlak (pogosto atmosferski)
Membranska upornost
TMP se razlikuje glede na vrsto membrane, zasnovo sistema in procesne pogoje.

Kontrolne spremenljivke:

3.2. TMP in postopek ultrafiltracije

TMP ima osrednjo vlogo pri koncentraciji beljakovin pri ultrafiltraciji, saj potiska raztopine beljakovin skozi membrano. Tlak mora biti dovolj visok, da premaga upor membrane in morebiten nakopičen material, vendar ne tako visok, da bi pospešil obraščanje.

Vpliv viskoznosti raztopine in koncentracije beljakovin

Viskoznost beljakovinskih raztopin:Višja viskoznost poveča upornost pretoka, kar zahteva višji TMP za ohranjanje enakega pretoka permeata. Na primer, dodajanje glicerola dovodu ali delovanje s koncentriranimi beljakovinami poveča viskoznost in s tem zahtevani operativni TMP.
Koncentracija beljakovin:Z naraščanjem koncentracije med fazo ultrafiltracijske koncentracije se poveča viskoznost raztopine, poveča se TMP in poveča se tveganje za obraščanje membrane ali koncentracijsko polarizacijo.
Darcyjev zakon:TMP, permeatni tok (J) in viskoznost (μ) so povezani z razmerjem TMP = J × μ × R_m (membranska upornost). Pri raztopinah beljakovin z visoko viskoznostjo je skrbna prilagoditev TMP ključnega pomena za učinkovito ultrafiltracijo.

Primeri:

Ultrafiltracija gostih raztopin protiteles zahteva skrbno upravljanje TMP, da se prepreči naraščajoča viskoznost.
PEGilacija ali druge modifikacije beljakovin spremenijo interakcijo z membrano, kar vpliva na TMP, potreben za želeni pretok.

3.3. Spremljanje in optimizacija TMP

Vzdrževanje TMP znotrajnormalni razpon transmembranskega tlakaje ključnega pomena za stabilno delovanje ultrafiltracijske membrane in kakovost izdelka. Sčasoma, ko ultrafiltracija napreduje, lahko polarizacija koncentracije in obraščanje povzročita dvig TMP, včasih hiter.

Prakse spremljanja:

Spremljanje v realnem času:TMP se spremlja preko dovoda, retentata in permeataoddajniki tlaka.
Ramanska spektroskopija:Uporablja se za neinvazivno spremljanje koncentracij beljakovin in pomožnih snovi, kar omogoča prilagodljiv nadzor TMP med ultrafiltracijo in diafiltracijo.
Napredni nadzor:Razširjeni Kalmanovi filtri (EKF) lahko obdelujejo podatke senzorjev in samodejno prilagajajo temperaturo hlajenja (TMP), da se prepreči prekomerno onesnaženje.
Nastavite začetno TMP znotraj normalnega območja:Ne prenizko, da bi zmanjšali pretok, ne previsoko, da bi preprečili hitro obraščanje.
Prilagodite TMP, ko se viskoznost poveča:Med fazo ultrafiltracijske koncentracije postopoma zvišujte TMP le po potrebi.
Nadzor pretoka krme in pH:Povečanje pretoka dovoda ali znižanje temperature pretoka (TMP) zmanjša polarizacijo koncentracije in obraščanje.
Čiščenje in zamenjava membrane:Višje vrednosti TMP so povezane s pogostejšim čiščenjem in krajšo življenjsko dobo membrane.

Optimizacijske strategije:

Primeri:

Korozijska obraba v linijah za predelavo beljakovin vodi do povečane temperature hlajenja (TMP) in zmanjšanega pretoka, kar zahteva čiščenje ali zamenjavo membrane za ponovno vzpostavitev normalnega delovanja.
Encimska predobdelava (npr. dodatek pektinaze) lahko zniža TMP in podaljša življenjsko dobo membrane med ultrafiltracijo beljakovin oljne ogrščice z visoko viskoznostjo.

3.4. TMP v sistemih TFF

Tangencialna (prečna) filtracija pretoka (TFF) deluje tako, da usmerja dovodno raztopino čez membrano in ne neposredno skozi njo, kar pomembno vpliva na dinamiko TMP.

Regulacija in ravnovesje TMP

Transmembranski tlak TFF (TFF TMP):Upravlja se z nadzorom pretoka dovoda in tlaka črpalke, da se prepreči prekomerna temperatura vode (TMP) in hkrati poveča pretok permeata.
Optimizacija parametrov:Povečanje pretoka krme zmanjša lokalno odlaganje beljakovin, stabilizira TMP in zmanjša obraščanje membrane.
Računalniško modeliranje:CFD modeli napovedujejo in optimizirajo TMP TFF za maksimalen izkoristek produkta, čistost in izkoristek – kar je še posebej pomembno za procese, kot sta izolacija mRNA ali zunajceličnih veziklov.

Primeri:

Pri bioprocesiranju optimalni TFF TMP doseže >70 % izkoristka mRNA brez razgradnje, kar prekaša metode ultracentrifugiranja.
Prilagodljivo krmiljenje TMP, ki temelji na matematičnih modelih in povratnih informacijah senzorjev, zmanjšuje pogostost zamenjave membrane in podaljšuje njeno življenjsko dobo z zmanjševanjem obraščanja.

Ključne ugotovitve:

Transmembranski tlak TMP je treba v TFF aktivno upravljati, da se ohrani učinkovitost procesa, pretok in zdravje membrane.
Sistematična optimizacija TMP znižuje obratovalne stroške, podpira pridobivanje visoko čistih produktov in podaljšuje življenjsko dobo membran pri ultrafiltraciji beljakovin in sorodnih procesih.

Spremljanje in merjenje visokih koncentracij beljakovin

Mehanizmi obraščanja in njihov odnos do viskoznosti

Glavne poti obraščanja pri ultrafiltraciji beljakovin

Na ultrafiltracijo beljakovin vpliva več različnih poti obraščanja:

Korozijska obraba:Pojavi se, ko se na površinah membran naberejo produkti korozije – običajno železovi oksidi. Ti zmanjšajo pretok in jih je težko odstraniti s standardnimi kemičnimi čistilnimi sredstvi. Korozijska obraba vodi do trajne izgube učinkovitosti membrane in sčasoma povečuje pogostost menjave membrane. Njen vpliv je še posebej hud pri membranah PVDF in PES, ki se uporabljajo pri čiščenju vode in v beljakovinskih aplikacijah.

Organsko obraščanje:Predvsem ga povzročajo beljakovine, kot je goveji serumski albumin (BSA), in se lahko okrepi v prisotnosti drugih organskih snovi, kot so polisaharidi (npr. natrijev alginat). Mehanizmi vključujejo adsorpcijo na membranske pore, zamašitev por in nastanek plasti pogače. Sinergijski učinki se pojavijo, ko je prisotnih več organskih komponent, pri čemer se sistemi z mešanimi obraščanji bolj obraščajo kot sistemi z enim samim proteinom.

Koncentracijska polarizacija:Med napredovanjem ultrafiltracije se zadržane beljakovine kopičijo blizu površine membrane, kar povečuje lokalno koncentracijo in viskoznost. To ustvari polarizacijsko plast, ki poveča nagnjenost k obraščanju in zmanjša pretok. Proces se pospeši z napredovanjem faze ultrafiltracijske koncentracije, na kar neposredno vplivata transmembranski tlak in dinamika pretoka.

Koloidno in mešano obraščanje:Koloidne snovi (npr. silicijev dioksid, anorganski minerali) lahko interagirajo z beljakovinami in ustvarijo kompleksne agregatne plasti, ki poslabšajo obraščanje membran. Prisotnost koloidnega silicijevega dioksida na primer znatno zniža hitrost pretoka, zlasti v kombinaciji z organsko snovjo ali v neoptimalnih pogojih pH.

Vpliv viskoznosti raztopine na razvoj obraščanja

Viskoznost beljakovinskih raztopin močno vpliva na kinetiko obraščanja in zbijanje membran:

Pospešeno obraščanje:Višja viskoznost beljakovinske raztopine poveča odpornost proti povratnemu transportu zadržanih topljenih snovi, kar omogoča hitrejše tvorjenje plasti pogače. To poveča transmembranski tlak (TMP), kar pospeši zbijanje membrane in obraščanje.

Učinki sestave raztopine:Vrsta beljakovin spreminja viskoznost; globularne beljakovine (npr. BSA) in razširjene beljakovine se obnašajo različno glede pretoka in polarizacije. Dodajanje spojin, kot so polisaharidi ali glicerol, znatno poveča viskoznost, kar spodbuja obraščanje. Aditivi in agregacija beljakovin pri visokih koncentracijah še dodatno povečajo hitrost mašenja membran, kar neposredno zmanjša tako pretok kot življenjsko dobo membrane.

Operativne posledice:Višja viskoznost zahteva povečano temperaturo medija (TMP) za vzdrževanje hitrosti filtracije v procesih filtracije s prečnim tokom. Dolgotrajna izpostavljenost visoki temperaturi medija (TMP) poveča nepopravljivo obraščanje, kar pogosto zahteva pogostejše čiščenje membrane ali prejšnjo zamenjavo membrane.

Vloga značilnosti krme

Značilnosti krme – in sicer lastnosti beljakovin in kemija vode – določajo resnost obraščanja:

Velikost in porazdelitev beljakovin:Večje ali agregirane beljakovine imajo večjo nagnjenost k zamašitvi por in nabiranju pogače, kar poveča viskoznost in nagnjenost k zbijanju med ultrafiltracijsko koncentracijo beljakovin.

pH:Povišan pH poveča elektrostatično odbojnost, kar preprečuje agregacijo beljakovin v bližini membrane in s tem zmanjšuje obraščanje. Nasprotno pa kisli pogoji zmanjšajo odbojnost, zlasti koloidnega silicijevega dioksida, kar poslabša obraščanje membrane in zmanjša hitrost pretoka.

Temperatura:Nižje temperature procesa običajno zmanjšajo kinetično energijo, kar lahko upočasni stopnjo obraščanja, hkrati pa poveča viskoznost raztopine. Visoke temperature pospešijo obraščanje, lahko pa tudi povečajo učinkovitost čiščenja.

Koloidna/anorganska snov:Prisotnost koloidnega silicijevega dioksida ali kovin poveča obraščanje, zlasti v kislih pogojih. Delci silicijevega dioksida povečajo skupno viskoznost raztopine in fizično zamašijo pore, zaradi česar je ultrafiltracijska koncentracija manj učinkovita ter skrajša celotno življenjsko dobo in delovanje membrane.

Ionska sestava:Dodajanje določenih ionskih spojin (Na⁺, Zn²⁺, K⁺) lahko zmanjša obraščanje s spreminjanjem elektrostatičnih in hidratacijskih sil med beljakovinami in membranami. Vendar pa ioni, kot je Ca²⁺, pogosto spodbujajo agregacijo in povečajo potencial za obraščanje.

Primeri:

Med prečno filtracijo bo pri krmi, bogati z beljakovinami z visoko molekulsko maso in povišano viskoznostjo, prišlo do hitrega upada pretoka, kar bo povečalo potrebe po čiščenju in zamenjavi.
Ko napajalna voda vsebuje koloidni silicijev dioksid in je nakisana, se agregacija in odlaganje silicijevega dioksida okrepi, kar močno poveča stopnjo obraščanja in zmanjša delovanje membrane.

Skratka, razumevanje medsebojnega vpliva viskoznosti raztopine, vrst obraščanja in značilnosti dovoda je bistvenega pomena za optimizacijo koncentracije ultrafiltracije, zmanjšanje obraščanja membrane in maksimiranje življenjske dobe membrane.

Polarizacija koncentracije in njeno obvladovanje

Kaj je koncentracijska polarizacija?

Koncentracijska polarizacija je lokalizirano kopičenje zadržane topljene snovi – kot so beljakovine – na vmesniku med membrano in raztopino med ultrafiltracijo. V kontekstu beljakovinskih raztopin se beljakovine, ki jih membrana zavrže, ko tekočina teče proti polprepustni membrani, ponavadi kopičijo v tanki mejni plasti ob površini. To kopičenje povzroči strm koncentracijski gradient: visoka koncentracija beljakovin tik ob membrani, veliko nižja v raztopini v razsutem stanju. Pojav je reverzibilen in ga urejajo hidrodinamične sile. Je v nasprotju z obraščanjem membrane, ki vključuje trajnejše odlaganje ali adsorpcijo znotraj ali na membrano.

Kako koncentracijska polarizacija poslabša viskoznost in obraščanje

Na površini membrane nenehno kopičenje beljakovin tvori mejno plast, ki povečuje lokalno koncentracijo topljenca. To ima dva pomembna učinka:

Lokalizirano povečanje viskoznosti:Ko se koncentracija beljakovin v bližini membrane poveča, se poveča tudi viskoznost raztopine beljakovin v tem mikroregiji. Povečana viskoznost ovira povratni transport topljenca stran od membrane, kar dodatno poveča koncentracijski gradient in ustvari povratno zanko, ki povečuje upor proti toku. To ima za posledico zmanjšan pretok permeata in večjo potrebo po energiji za nadaljnjo filtracijo.

Olajšanje obraščanja membrane:Visoka koncentracija beljakovin v bližini membrane poveča verjetnost agregacije beljakovin in v nekaterih sistemih nastanek gelske plasti. Ta plast zamaši membranske pore in dodatno poveča upor proti pretoku. Takšni pogoji so idealni za nastanek nepopravljivega obraščanja, kjer se beljakovinski agregati in nečistoče fizično ali kemično vežejo na membransko matrico.

Eksperimentalno slikanje (npr. elektronska mikroskopija) potrjuje hitro aglomeracijo nanodelnih beljakovinskih grozdov na membrani, ki lahko zrastejo v znatne usedline, če operativne nastavitve niso ustrezno upravljane.

Strategije za zmanjšanje polarizacije koncentracije

Upravljanje koncentracijske polarizacije pri ultrafiltracijski koncentraciji beljakovin ali prečni filtraciji zahteva dvojni pristop: prilagajanje hidrodinamike in uglaševanje operativnih parametrov.

Optimizacija hitrosti navzkrižnega toka:
Zvišanje hitrosti prečnega toka poveča tangencialni tok čez membrano, kar spodbuja strižne sile in tanjša mejno plast koncentracije. Močnejše strižne sile odstranjujejo nakopičene beljakovine s površine membrane, kar zmanjšuje tako polarizacijo kot tudi tveganje za obraščanje. Na primer, uporaba statičnih mešalnikov ali uvajanje plinskega prepihovanja moti plast topljenca, kar znatno izboljša pretok permeata in učinkovitost procesa filtracije s prečnim tokom.

Spreminjanje operativnih parametrov:

Transmembranski tlak (TMP):TMP je tlačna razlika na membrani in gonilna sila ultrafiltracije. Vendar pa lahko zvišanje TMP za pospešitev filtracije povzroči nasprotni učinek, saj okrepi koncentracijsko polarizacijo. Upoštevanje normalnega območja transmembranskega tlaka – ne prekoračitev omejitev, določenih za ultrafiltracijo beljakovin – pomaga preprečiti prekomerno kopičenje topljencev in s tem povezano povečanje lokalne viskoznosti.

Strižna hitrost:Strižna hitrost, ki je funkcija hitrosti prečnega toka in zasnove kanala, igra osrednjo vlogo pri dinamiki transporta topljencev. Visoka strižna sila ohranja polarizacijsko plast tanko in mobilno, kar omogoča pogosto obnavljanje območja z manj topljencev v bližini membrane. Povečanje strižne hitrosti skrajša čas, ki ga morajo beljakovine kopičiti, in zmanjša porast viskoznosti na vmesniku.

Lastnosti vira:Prilagajanje lastnosti vhodne beljakovinske raztopine – kot je znižanje viskoznosti beljakovinske raztopine, zmanjšanje vsebnosti agregatov ali nadzor pH in ionske moči – lahko pomaga zmanjšati obseg in vpliv koncentracijske polarizacije. Predobdelava krme in spremembe formulacije lahko izboljšajo delovanje ultrafiltracijske membrane in podaljšajo njeno življenjsko dobo z zmanjšanjem pogostosti čiščenja membrane.

Primer uporabe:
Obrat, ki uporablja tangencialno filtracijo (TFF) za koncentriranje monoklonskih protiteles, uporablja skrbno optimizirane hitrosti prečnega toka in vzdržuje TMP znotraj strogega okna. S tem upravljavci zmanjšajo polarizacijo koncentracije in obrabo membrane, kar zmanjša tako pogostost menjave membran kot tudi cikle čiščenja – kar neposredno znižuje obratovalne stroške in izboljšuje izkoristek izdelka.

Ustrezno prilagajanje in spremljanje teh spremenljivk – vključno z merjenjem viskoznosti raztopine beljakovin v realnem času – sta bistvena za optimizacijo delovanja ultrafiltracijske koncentracije in ublažitev neželenih učinkov, povezanih s polarizacijo koncentracije pri predelavi beljakovin.

Optimizacija ultrafiltracije za visokoviskozne beljakovinske raztopine

6.1. Najboljše operativne prakse

Ohranjanje optimalne ultrafiltracijske učinkovitosti z visoko viskoznimi beljakovinskimi raztopinami zahteva občutljivo ravnovesje med transmembranskim tlakom (TMP), koncentracijo beljakovin in viskoznostjo raztopine. TMP – razlika v tlaku na membrani – neposredno vpliva na hitrost koncentracije ultrafiltracijskih beljakovin in stopnjo obraščanja membrane. Pri obdelavi viskoznih raztopin, kot so monoklonska protitelesa ali visoko koncentrirane serumske beljakovine, lahko vsako prekomerno povečanje TMP sprva poveča pretok, vendar tudi hitro pospeši obraščanje in kopičenje beljakovin na površini membrane. To vodi do ogroženega in nestabilnega procesa filtracije, kar potrjujejo slikovne študije, ki kažejo, da se pri povišanem TMP in koncentracijah beljakovin nad 200 mg/ml tvorijo goste beljakovinske plasti.

Optimalni pristop vključuje delovanje sistema blizu kritične temperature temperature (TMP), vendar ne prekoračitve te vrednosti. Na tej točki je produktivnost maksimalna, vendar tveganje za nepopravljivo obraščanje ostaja minimalno. Pri zelo visokih viskoznostih nedavne ugotovitve kažejo na zmanjšanje TMP in hkratno povečanje pretoka dovajanja (filtracija s prečnim tokom), da se ublaži polarizacija koncentracije in odlaganje beljakovin. Študije koncentracije Fc-fuzijskih beljakovin na primer kažejo, da nižje nastavitve TMP pomagajo ohranjati stabilen pretok, hkrati pa zmanjšujejo izgubo produkta.

Postopno in metodično povečevanje koncentracije beljakovin med ultrafiltracijo je ključnega pomena. Nenadni koraki koncentracije lahko prehitro prisilijo raztopino v režim visoke viskoznosti, kar poveča tako tveganje agregacije kot tudi resnost obraščanja. Namesto tega postopno zvišanje ravni beljakovin omogoča vzporedno prilagajanje procesnih parametrov, kot so TMP, hitrost prečnega toka in pH, kar pomaga ohranjati stabilnost sistema. Študije primerov encimske ultrafiltracije potrjujejo, da vzdrževanje nižjih obratovalnih tlakov v teh fazah zagotavlja nadzorovano povečanje koncentracije, kar zmanjšuje upad pretoka in hkrati ščiti celovitost izdelka.

6.2. Pogostost zamenjave in vzdrževanje membrane

Pogostost zamenjave membrane pri ultrafiltraciji je tesno povezana z indikatorji obraščanja in upadanja pretoka. Namesto da bi se kot indikator konca življenjske dobe zanašali zgolj na relativni upad pretoka, se je izkazalo, da je spremljanje specifične odpornosti proti obraščanju – kvantitativne mere, ki predstavlja odpornost, ki jo povzroča nakopičen material – zanesljivejše, zlasti pri mešanih beljakovinah ali beljakovinah in polisaharidih, kjer se obraščanje lahko pojavi hitreje in bolj intenzivno.

Prav tako je ključnega pomena spremljanje dodatnih kazalnikov obraščanja. Vidni znaki površinskega odlaganja, neenakomeren pretok permeata ali vztrajno povečanje TMP (kljub čiščenju) so opozorilni signali naprednega obraščanja, ki predhodi odpovedi membrane. Tehnike, kot je sledenje modificiranega indeksa obraščanja (MFI-UF) in njegova korelacija z delovanjem membrane, omogočajo napovedno načrtovanje zamenjav namesto reaktivnih sprememb, s čimer se zmanjša čas izpada in nadzorujejo stroški vzdrževanja.

Celovitost membrane ni ogrožena le zaradi kopičenja organskih onesnaževal, temveč tudi zaradi korozije, zlasti pri procesih, ki potekajo pri ekstremnem pH ali z visokimi koncentracijami soli. Za obvladovanje korozije in odlaganja onesnaževal je treba uvesti redne preglede in kemično čiščenje. Ko se opazi onesnaženje, povezano s korozijo, je treba prilagoditi pogostost čiščenja membrane in intervale zamenjave, da se zagotovi trajna življenjska doba membrane in dosledno delovanje ultrafiltracijske membrane. Temeljito, redno vzdrževanje je bistvenega pomena za ublažitev vpliva teh težav in podaljšanje učinkovitega delovanja.

6.3. Nadzor procesa in merjenje viskoznosti na liniji

Natančno merjenje viskoznosti beljakovinske raztopine v realnem času je bistvenega pomena za nadzor procesa pri ultrafiltraciji, zlasti ko se koncentracije in viskoznosti povečujejo. Sistemi za merjenje viskoznosti v liniji zagotavljajo neprekinjeno spremljanje, kar omogoča takojšnje povratne informacije in dinamično prilagajanje sistemskih parametrov.

Nove tehnologije so spremenile področje merjenja viskoznosti beljakovinskih raztopin:

Ramanova spektroskopija s Kalmanovim filtriranjemRamanska analiza v realnem času, podprta z razširjenimi Kalmanovimi filtri, omogoča robustno sledenje koncentraciji beljakovin in sestavi pufra. Ta pristop poveča občutljivost in natančnost ter podpira avtomatizacijo procesov za ultrafiltracijsko koncentracijo in diafiltracijo.

Avtomatizirana kinematična kapilarna viskozimetrijaZ uporabo računalniškega vida ta tehnologija samodejno meri viskoznost raztopine, s čimer odpravlja ročne napake in ponuja ponovljivo, multipleksno spremljanje v več procesnih tokovih. Validirana je tako za standardne kot za kompleksne formulacije beljakovin in zmanjšuje posege med fazo ultrafiltracijske koncentracije.

Mikrofluidne reološke napraveMikrofluidni sistemi zagotavljajo podrobne, neprekinjene reološke profile, tudi za ne-Newtonove raztopine beljakovin z visoko viskoznostjo. Ti so še posebej dragoceni v farmacevtski proizvodnji, saj podpirajo strategije procesne analitične tehnologije (PAT) in integracijo s povratnimi zankami.

Nadzor procesov z uporabo teh orodij omogoča izvajanje povratnih zank za prilagajanje temperature pretoka (TMP), hitrosti dovajanja ali hitrosti prečnega toka v realnem času kot odziv na spremembe viskoznosti. Če na primer linijsko zaznavanje zazna nenaden porast viskoznosti (zaradi povečanja koncentracije ali agregacije), se lahko TMP samodejno zmanjša ali hitrost prečnega toka poveča, da se omeji začetek polarizacije koncentracije pri ultrafiltraciji. Ta pristop ne le podaljša življenjsko dobo membrane, temveč tudi podpira dosledno kakovost izdelkov z dinamičnim upravljanjem dejavnikov, ki vplivajo na viskoznost beljakovinskih raztopin.

Izbira najprimernejše tehnologije za spremljanje viskoznosti je odvisna od specifičnih zahtev aplikacije ultrafiltracije, vključno s pričakovanim razponom viskoznosti, kompleksnostjo formulacije beljakovin, potrebami po integraciji in stroški. Ta napredek pri spremljanju v realnem času in dinamičnem nadzoru procesov je znatno izboljšal sposobnost optimizacije ultrafiltracije za raztopine beljakovin z visoko viskoznostjo, kar zagotavlja tako operativno stabilnost kot visok izkoristek produkta.

Odpravljanje težav in pogoste težave pri ultrafiltraciji beljakovin

7.1. Simptomi, vzroki in zdravila

Povečan transmembranski tlak

Povišanje transmembranskega tlaka (TMP) med ultrafiltracijo kaže na naraščajočo upornost na membrani. Učinki transmembranskega tlaka na ultrafiltracijo so neposredni: normalno območje transmembranskega tlaka je običajno odvisno od procesa, vendar je treba vztrajno povečanje raziskati. Izstopata dva pogosta vzroka:

Višja viskoznost beljakovinske raztopine:Z naraščanjem viskoznosti beljakovinskih raztopin – običajno pri visoki koncentraciji beljakovin pri ultrafiltraciji – se poveča tlak, potreben za pretok. To je izrazito v končnih fazah koncentracije in diafiltracije, kjer so raztopine najbolj viskozne.
Obremenitev membrane:Oblagalne snovi, kot so beljakovinski agregati ali mešanice polisaharidov in beljakovin, se lahko oprimejo membranskih por ali jih blokirajo, kar povzroči hiter porast TMP.

Pravna sredstva:

Znižajte TMP in povečajte pretok krmeZmanjšanje TMP ob hkratnem povečanju hitrosti dovajanja zmanjša polarizacijo koncentracije in nastanek gelske plasti, kar spodbuja stabilen pretok.
Redno čiščenje membraneDoločite optimalno pogostost čiščenja membrane za odstranitev nakopičenih onesnaževal. Spremljajte učinkovitost z merjenjem viskoznosti beljakovinske raztopine po čiščenju.
Zamenjajte starajoče se membraneČe čiščenje ni zadostno ali je dosežena življenjska doba membrane, bo morda potrebna pogostejša menjava membrane.

Padajoča hitrost pretoka: Diagnostično drevo

Dosledno zmanjševanje pretoka med fazo ultrafiltracijske koncentracije kaže na težave s produktivnostjo. Sledite temu diagnostičnemu pristopu:

Spremljajte TMP in viskoznost:Če se je oboje povečalo, preverite morebitne usedline ali prisotnost gelske plasti.
Preverite sestavo krme in pH:Premiki tukaj lahko spremenijo viskoznost beljakovinskih raztopin in spodbudijo obraščanje.
Ocenite delovanje membrane:Zmanjšanje pretoka permeata kljub čiščenju kaže na možno poškodbo membrane ali nepopravljivo obraščanje.

Rešitve:

Optimizirajte temperaturo, pH in ionsko moč v dovodu, da zmanjšate obraščanje in polarizacijo koncentracije pri ultrafiltraciji.
Za prekinitev gelskih plasti in obnovitev pretoka uporabite površinsko modificirane ali rotirajoče membranske module.
Redno merite viskoznost beljakovinske raztopine, da predvidite spremembe, ki vplivajo na pretok.

Hitro obraščanje ali nastanek gelske plasti

Hitro nastajanje gelske plasti je posledica prekomerne koncentracijske polarizacije na površini membrane. Transmembranski tlak pri prečni filtraciji (TFF) je še posebej občutljiv pri pogojih visoke viskoznosti ali visoke vsebnosti beljakovin.

Strategije za ublažitev:

Za zmanjšanje vezave in pritrjevanja beljakovin uporabite hidrofilne, negativno nabite membranske površine (npr. membrane iz poliviniliden fluorida [PVDF]).
Pred ultrafiltracijo krmo predhodno obdelajte s koagulacijo ali elektrokoagulacijo, da odstranite snovi, ki povzročajo močno obraščanje.
V postopek filtracije s prečnim tokom vključite mehanske naprave, kot so vrtljivi moduli, da zmanjšate debelino plasti pogače in odložite nastanek plasti gela.

7.2. Prilagajanje spremenljivosti krme

Sistemi za ultrafiltracijo beljakovin se morajo prilagoditi spremenljivosti lastnosti ali sestave beljakovin v krmi. Dejavniki, ki vplivajo na viskoznost raztopin beljakovin – kot so sestava pufra, koncentracija beljakovin in nagnjenost k agregaciji – lahko spremenijo delovanje sistema.

Strategije odzivanja

Spremljanje viskoznosti in sestave v realnem času:Za hitro zaznavanje sprememb v dovodu uporabite linijske analitične senzorje (Ramanova spektroskopija + Kalmanovo filtriranje) in s tem prekašajte starejše UV ali IR metode.
Prilagodljivo krmiljenje procesov:Prilagodite nastavitve parametrov (pretok, TMP, membranska selekcija) kot odziv na zaznane spremembe. Na primer, povečana viskoznost raztopine beljakovin lahko zahteva nižji TMP in visoke strižne hitrosti.
Izbira membrane:Uporabite membrane z velikostjo por in površinsko kemijo, optimizirano za trenutne lastnosti krme, pri čemer uravnotežite zadrževanje beljakovin in pretok.
Predobdelava krme:Če nenadne spremembe v naravi dovoda spodbujajo obraščanje, uvedite korake koagulacije ali filtracije pred ultrafiltracijo.

Primeri:

Pri bioprocesiranju bi morale preklopi pufrov ali spremembe v agregatih protiteles sprožiti TMP in prilagoditve pretoka prek krmilnega sistema.
Pri kromatografsko povezani ultrafiltraciji lahko prilagodljivi algoritmi za optimizacijo mešanja in celoštevilskih števil zmanjšajo variabilnost in obratovalne stroške, hkrati pa ohranijo delovanje ultrafiltracijske membrane.

Rutinsko spremljanje meritev viskoznosti beljakovinske raztopine in takojšnje prilagajanje procesnim pogojem pomagata optimizirati koncentracijo ultrafiltracije, ohranjati prepustnost ter zmanjšati obraščanje membrane in polarizacijo koncentracije.

Pogosto zastavljena vprašanja

8.1. Kakšno je normalno območje transmembranskega tlaka pri ultrafiltraciji beljakovinskih raztopin?

Normalni razpon transmembranskega tlaka (TMP) v ultrafiltracijskih sistemih za koncentracijo beljakovin je odvisen od vrste membrane, zasnove modula in značilnosti dovoda. Pri večini procesov ultrafiltracije beljakovin se TMP običajno vzdržuje med 1 in 3 bari (15–45 psi). Vrednosti TMP nad 0,2 MPa (približno 29 psi) lahko povzročijo poškodbo membrane, hitro obraščanje in skrajšano življenjsko dobo membrane. V biomedicinskih in bioprocesnih aplikacijah priporočeni TMP na splošno ne sme presegati 0,8 bara (~12 psi), da se prepreči ruptura membrane. Pri procesih, kot je filtracija s prečnim tokom, ohranjanje tega območja TMP zagotavlja tako izkoristek kot celovitost beljakovin.

8.2. Kako viskoznost beljakovinskih raztopin vpliva na učinkovitost ultrafiltracije?

Viskoznost beljakovinske raztopine neposredno vpliva na učinkovitost ultrafiltracijske koncentracije. Visoka viskoznost poveča upornost pretoka in zviša TMP, kar ima za posledico zmanjšan pretok permeata in hitro obraščanje membrane. Ta učinek je izrazit pri monoklonskih protitelesih ali Fc-fuzijskih proteinih pri visoki koncentraciji, kjer se viskoznost poveča zaradi interakcij med proteini in učinkov naboja. Upravljanje in optimizacija viskoznosti s pomožnimi snovmi ali encimskimi obdelavami izboljša pretok, zmanjša obraščanje in omogoča doseganje višjih koncentracij med fazo ultrafiltracijske koncentracije. Spremljanje meritev viskoznosti beljakovinske raztopine je ključnega pomena za ohranjanje učinkovite obdelave.

8.3. Kaj je koncentracijska polarizacija in zakaj je pomembna pri TFF?

Koncentracijska polarizacija pri ultrafiltraciji je kopičenje beljakovin na površini membrane, kar povzroča gradient med raztopino v razsutem stanju in membranskim vmesnikom. Pri filtraciji s prečnim tokom to vodi do povečane lokalne viskoznosti in potencialno reverzibilnega zmanjšanja pretoka. Če se ne obvladuje, lahko spodbudi obraščanje membrane in zmanjša učinkovitost sistema. Reševanje koncentracijske polarizacije pri ultrafiltraciji vključuje optimizacijo prečnih pretokov, temperature pretoka in izbire membrane za ohranjanje tanke polarizacijske plasti. Natančen nadzor ohranja visoko prepustnost in nizko tveganje za obraščanje.

8.4. Kako se odločim, kdaj zamenjati ultrafiltracijsko membrano?

Ultrafiltracijsko membrano zamenjajte, ko opazite izrazit upad pretoka (pretoka), vztrajno povečanje TMP, ki ga standardno čiščenje ne more odpraviti, ali vidno obraščanje, ki ostane po čiščenju. Dodatni kazalniki vključujejo izgubo selektivnosti (neuspeh pri zavrnitvi ciljnih beljakovin, kot je bilo pričakovano) in nezmožnost doseganja specifikacij delovanja. Spremljanje pogostosti zamenjave membrane z rednim testiranjem pretoka in selektivnosti je temelj za podaljšanje življenjske dobe membrane v procesih ultrafiltracije in koncentracije beljakovinskih raztopin.

8.5. Katere obratovalne parametre lahko prilagodim, da zmanjšam obraščanje beljakovin v TFF?

Ključni operativni parametri za zmanjšanje onesnaženja z beljakovinami pri filtraciji s prečnim tokom vključujejo:

Vzdržujte ustrezno hitrost prečnega pretoka, da zmanjšate lokalno kopičenje beljakovin in obvladate polarizacijo koncentracije.
Delujte znotraj priporočenega območja TMP, običajno 3–5 psi (0,2–0,35 bara), da preprečite prekomerno puščanje izdelka in poškodbe membrane.
Za omejitev nepopravljivega obraščanja redno uporabljajte protokole čiščenja membran.
Spremljajte in po potrebi predhodno obdelajte dovodno raztopino za nadzor viskoznosti (na primer z encimskimi obdelavami, kot je pektinaza).
Izberite membranske materiale in velikosti por (MWCO), ki so primerne za ciljno velikost beljakovin in procesne cilje.

Integracija hidrociklonske predfiltracije ali encimske predobdelave lahko izboljša delovanje sistema, zlasti pri visokoviskoznih surovinah. Natančno spremljajte sestavo surovin in dinamično prilagajajte nastavitve, da zmanjšate obrabo membrane in optimizirate fazo ultrafiltracijske koncentracije.